La villa de Ampudia entra en el siglo XVI de la mano de Pedro de Ayala, conde de Salvatierra, el cual continúa con la política despótica que desde que heredara el señorío había aplicado a su posesión, lo que le llevará  a mantener entre 1501 y 1510, numerosos pleitos con los vecinos.

Más destacado en la vida ampudiana de principios del siglo XVI es el paso por la villa del entonces rey y futuro emperador Carlos V, en su primer viaje por España tras su designación real. Buena parte de este viaje transcurre por tierras de Palencia, como testimonian los cronistas que como, Lorenzo Vital, acompañan al rey. En estas crónicas se nos dice cómo el día 2 de noviembre de 1517 el rey comió en Becerril y cenó y pernoctó en Ampudia.

La batalla de Ampudia.

En la mañana del 15 de enero de 1521, tropas al servicio del emperador,

comandadas por los capitanes Zapata y Beaumont, al pasar por Ampudia fueron abucheados por quienes ocupaban la cerca de la villa y rechazadas las pretensiones de Beaumont de recibir abastecimiento para sus tropas. Esta afrenta es respondida por Beaumont con preparativos de asedio ante lo cual los de Ampudia se apresuraron a rendir la villa, haciendo lo mismo poco después Sancho del Campo, alcaide del castillo al servicio del conde de Salvatierra aliado de los comuneros.

En poco tiempo la Santa Junta reacciona en favor de su aliado y dispone una contraofensiva. En la noche del 15 al 16 sale Padilla de Valladolid con sus tropas portando numerosa artillería reuniéndose con Acuña y su gente en Trigueros, juntando entre ambos en torno a cuatro mil hombres. El ejército comunero se presenta ante los muros de Ampudia la mañana del día 17 ante lo cual Beaumont opta por huir al vecino castillo de Torremormojón. Padilla persiguió a Beaumont hasta Torremormojón e inició un asalto que solo la llegada de la noche consiguió atemperar, momento que aprovecharon Francés de Beaumont y Pedro Zapata para dejar la villa con sus hombres y huir hacia Torrelobatón. A la mañana siguiente, Padilla continúa con el asedio de Torremormojón defendido ahora heroicamente por sus vecinos hasta que la amenaza del fuego les hizo entablar negociaciones para una honrosa rendición. Inmediatamente, Padilla regresa a Ampudia donde continúan los esfuerzos por reducir a la guarnición dejada por Beaumont, por parte de las huestes del obispo AcuñaFinalmente Padilla entablará negociaciones con los defensores con el fin de evitar un asedio que se preveía largo y cruento permitiéndoles salir con armas y caballos. Recuperó así el conde de Salvatierra sus dominios castellanos, pero Padilla y Acuña no pudieron ampliar su éxito tomando Medina de Rioseco como era su intención, por falta de pólvora pues la Santa Junta se negó a entregársela. Desde ese momento el empuje comunero fue debilitándose hasta ser derrotado por completo el 23 de abril de 1521 en Villalar. La batalla descrita constituye el principal hecho de armas relacionado con el Castillo de Ampudia y los cronistas han querido ver las huellas de la misma en sus muros cada vez que se han acercado a éste buscando rememorar su historia.

 Retorno de la Villa al dominio señorial.

Pese a las promesas dirigidas a los vecinos de Ampudia de mantener la villa dentro de la jurisdicción  real, en 1525 Atanasio de Ayala y Rojas, hijo del Conde de Salvatierra, pudo recuperar parte del feudo de su padre gracias al pago de veinte mil ducados, aunque dada la su minoría de edad quedará bajo  la tutela del condestable de Castilla, período este en el que el castillo de Ampudia se convertirá por algún tiempo en prisión del delfín de Francia.

Con motivo de la derrota de los franceses en la batalla de Pavía el 25 de febrero de 1525, el rey Francisco I, cautivo en España, se ve obligado a firmar el Tratado de Madrid de 14 de enero de 1526, por el cual, y como garantía de su cumplimiento, debe entregar a sus dos hijos mayores, el Delfín Francisco, y Enrique, Duque de Orléans, al Emperador que los retendrá en tanto que aquél resuelva las condiciones acordadas para su liberación. El Emperador confía la custodia de los llamados "delfines" de Francia al Condestable Don Iñigo, misión que éste encomendó a su vez a su hijo, Don Juan de Tovar. Comienza así un largo peregrinar por las posesiones de los Velasco, que durará hasta la firma de la Paz de las Damas (Tratado de Cambray) el 1 de julio de 1530. Entre los lugares que acogieron a los príncipes figuran los castillos de Villalpando, Berlanga y Ampudia. Tras la muerte del Condestable, Don Atanasio de Ayala y Rojas aparece como señor de la Villa, libre ya de tutela alguna.